La tesis doctoral de Xavier Mulet investiga los mecanismos de la resistencia antibiótica en el tratamiento de la infección respiratoria crónica

Redacción
La tesis doctoral de Xavier Mulet, presentada recientemente y con éxito ante un tribunal de la Universitat de les Illes Balears (UIB) investiga los mecanismos implicados en la resistencia antibiótica de los biofilms de Pseudomonas aeruginosa, así como la implicación de la hiperexpresión de bombas de expulsión activa en la aparición de interacciones antagónicas entre diferentes mecanismos de resistencia durante el tratamiento de la infección respiratoria crónica

En los últimos años, la azitromicina ha mostrado resultados prometedores en el tratamiento de la infección respiratoria crónica por Pseudomonas aeruginosa. Aunque no presenta actividad bactericida frente este microorganismo en cultivo planctónico, se sabe que este macrólido inhibe el crecimiento en forma de biofilm gracias a su capacidad para bloquear o interferir el sistema de percepción de quórum bacteriano. En el transcurso de las infecciones crónicas a menudo se seleccionan mutantes que presentan un grado de adaptación al nicho ecológico y los antibióticos, tal como procede con el mutante nfxB, gen regulador negativo de la bomba de expulsión activa MexCD-OprJ.

Este fenotipo frecuentemente es aislado en muestras respiratorias de pacientes con fibrosis quística, EPOC y bronquiectasias, y se caracteriza porque presenta resistencia a los antibióticos que pueden actuar como sustrato (como ciprofloxacino, cefepima o azitromicina) y porque presenta una marcada hipersensibilidad a los antibióticos betalactámicos no sustratos de la bomba y aminoglucósidos.

Por lo tanto, uno de los principales objetivos de la tesis doctoral de Francisco Javier Mulet Aguiló ha sido averiguar si durante la exposición prolongada a azitromicina se seleccionan mutantes nfxB tanto en cultivo planctónico como en forma de biofilm. Además, se ha evaluado el impacto de la hiperproducción de alginato y el efecto de la hipermutación sobre el efecto bactericida, sobre la dinámica de desarrollo de resistencias a azitromicina y sobre la posible aparición de resistencias cruzadas. También ha sido objeto de estudio la caracterización del mutante nfxB, así como la relación entre la hiperexpresión de MexCD-OprJ (a través de la mutación en su gen regulador nfxB), la actividad de la cefalosporinasa cromosómica AMPc, y las bombas de expulsión intrínsecas MexAB-OprM y MexXY-OprM.

Para llevar a cabo estos objetivos se construyeron mutantes deficientes en el gen MUCA (la variante mucoide Paomia), mudos (cepa hipermutadora Paomia) y la combinación de ambos (PAOMSA) mediante el sistema Cre-Lox. Seguidamente se procedió a evaluar el comportamiento del mutantes en crecimiento en forma de biofilm cuando son tratados con diferentes concentraciones de azitromicina, así como la dinámica de desarrollo de resistencias durante algunos días.

Se caracterizaron los mutantes resistentes a azitromicina, se determinó el perfil de sensibilidad, se cuantificó la expresión relativa de mexD como representante de la bomba de expulsión activa MexCD-OprJ mediante PCR a tiempo real, y finalmente se secuenció el gen regulador nfxB revelando varias mutaciones inactivantes. En resumen, los resultados obtenidos por el investigador de la UIB han permitido demostrar que durante el tratamiento de biofilms con azitromicina hay una selección de mutantes nfxB a las cepas salvajes, las hiperproductores de alginato y particularmente a las cepas hipermutadores.

Seguidamente se construyó el mutante nulo nfxB y se procedió a evaluar las propiedades biológicas, la sensibilidad al complemento del suero humano y la tasa y frecuencia de mutación en rifampicina. Finalmente se analizó el transcriptoma, se mostró que aparentemente no se sobreexpresan genes implicados en la resistencia antibiótica, exceptuando aquellos que pertenecen al operón mexCD-oprJ. Aunque el perfil de proteínas fijadoras de penicilina no se encontraron diferencias entre el mutante nfxB y la cepa de referencia, el análisis de proteínas de membrana externa reveló una disminución de la expresión de OprM, responsable de la hipersensibilidad a aminoglucósidos y betalactámicos con la excepción del imipenem.

De forma análoga, la disminución de la expresión de OprM no justificó la reversión del fenotipo de resistencia a betalactámicos en el mutante nfxB-dacB. Sin embargo, la determinación fraccionada (extracto crudo, periplasma y sobrenadante) de la actividad betalactamasa específica del mutante nfxB y del mutante doble nfxB-dacB mostró un drástico descenso de la actividad periplasmático como consecuencia de la inactivación de nfxB, a costa de un aumento de la actividad medida en el sobrenadante.

A continuación se evaluó si esta diferencia resultaba beneficiosa en el seno de un biofilm tratado con antibióticos betalactámicos, y se demostró que efectivamente en este escenario el mutante nfxB tiene una supervivencia superior a la de sus cepas parentales tanto en condiciones de inducción como en condiciones de hiperproducción constitutiva para desrepressió de la expresión de AMPc, a través de la mutación en dacB.

Así, los datos obtenidos por Francisco Javier Mulet Aguiló revelan que la hipersensibilidad a betalactámicos se debe a la incapacidad para acumular AMPc al espacio periplasmático, y que se produce una permeabilización hacia el medio extracelular. Sin embargo un análisis de este fenómeno nos ha permitido describir como esta permeabilización resulta beneficiosa para la comunidad formadora del biofilm, dado que AMPc quedaría recluido dentro de su matriz. La posterior inactivación de nfxB en cepas clínicas demostró que este hallazgo no es específica de la PAO1.

Finalmente, los datos preliminares sugieren que la permeabilización que experimenta AMPc el mutante nfxB ocurre también con otras betalactamasas, particularmente de las clases B y D.

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